Manuales de resolución de problemas

Están disponibles los manuales de resolución de problemas de:

  • Inmunodifusión radial. Guía solucionadora de problemas
  • Inmunofluorescencia indirecta. Antes de empezar

Problema Posible causa Sugerencia

No se ve el halo de la muestra

1. Muestra en mal estado
2. Poca concentración
Si los controles dan bien, usar muestra fresca.
Si los controles dan bien sembrar 2 veces.
Halos muy grandes para el suero control ( > 9
mm)

Calibrador deteriorado  Ver fecha de vencimiento
Halos muy grandes para la muestra   Elevada concentración de la proteína analizada Diluir la muestra 1/10 en PBS.
Halos muy pequeños para el suero control (<4mm)
 
Calibrador deteriorado Ver fecha de vencimiento
Halos muy pequeños para la muestra   Muy baja concentración de la proteína analizada Sembrar dos veces o concentrar con bolsas de diálisis con PEG.
Doble halo para el suero control Si es débil, en los equipos de Igs., puede deberse a la presencia de
alotipos. Si es nítido se puede pensar en un deterioro de la placa.
El calibrador no sirve, debe comunicarse con Biocientífica para
reemplazarlo por uno nuevo.
Doble halo para la muestra Si es débil puede deberse a depósitos de fibrina o lípidos. / Si se
trata de Igs. puede deberse a la presencia de alotipos. / Si es
intenso la causa podría ser el deterioro de la muestra y la presencia
de fragmentos con determinantes antigénicos comunes.
No informar. Hacer un SDS-PAGE de la muestra para ver la composición.
Pedir nueva muestra fresca.
Halos no circulares 1. Poco volumen de muestra sembrado
2. Deshidratación o distorsión del gel
3. Incubación o almacenado en forma no horizontal
4. Pocillo roto
5. La muestra no se sembró solo en el pocillo
Sembrar nuevamente en otro pocillo
Asegurarse del buen cierre de la placa y de la temperatura de
almacenamiento. (Las placas conservadas en el fondo de la heladera
suelen congelarse). Observar la fecha de vencimiento.
Si el tiempo en que ha estado en posición no vertical fue prolongado la
placa ya no sirve y debe usarse otra. Ej.: cuando se guardan paradas en la
puerta de la heladera.
Sembrar nuevamente en otro pocillo.
Sembrar nuevamente en otro pocillo.
El calibrador da un halo menor al esperado Temperatura y/o tiempo de incubación.
Calibración de la pipeta.
Pipeteo incorrecto
Lectura incorrecta con regla. (Jamás se debe leer con una regla
milimetrada normal ya que el error que se comete es muy grande)
El valor que figura en el vial del calibrador fue obtenido con una
incubación a 22°C y durante el tiempo requerido para el analito en
cuestión. Si la temperatura de incubación fue menor, prolongarla 12 ó 24 horas más.
Calibrar la pipeta usando balanza analítica.
Usar pipeta Hamilton o micropipetas con microtips realizando pipeteo
reverso (1)
El borde del halo debe ser tangencial a los bordes internos de las lineas
exteriores de la regla de medición.
El pocillo está lleno de líquido Condensación de humedad Dejar la placa unos minutos destapada o sacar el líquido del pocillo con
una micropipeta.
El halo de la placa de baja concentración se ve
muy tenue
Inherente a la metodología. Incubar 24 hs más.

(1) El pipeteo reverso consiste en tomar hasta el segundo tope y descargar hasta el primero. De está manera queda algo de muestra en el tip, que se deberá eliminar.

Algunos puntos a tener en cuenta:

  • Formas poliméricas de Igs., como las que se ven en mieloma múltiple o en la macroglobulinemia de Waldenströn, difunden más lentamente que los monómeros por lo que se suberstima la concentración.
  • Los complejos de alto PM que pueden circular en la crioglobulinemia o en artritis reumatoidea resultarán en falsos bajos valores por la misma causa que se analizó en el itm anterior.
  • Formas 7S monoméricas de IgM presentes en pacientes con macroglobulinemia, LES, AR, ataxia telangiectasia pueden conducir a falsos resultados elevados.
  • Las crioglobulinas pueden precipitar a temperatura ambiente y atrapar Igs, con el consiguiente error por defecto.
  • Chequear la fecha de vencimiento del kit.
  • Asegurarse de que todos los componentes han sido conservados como lo indica
  • el inserto del kit.
  • No sustituir ni mezclar reactivos de lotes diferentes.
  • Documentar por escrito el esquema o plan del ensayo.
  • Obtener todos los materiales que necesitará durante el ensayo. (tips, papel
  • absorbente, pipetas, recipiente para residuos, etc.)
  • Evitar rupturas de cadena de frío innecesarias. Si se debe fraccionar una
  • lámina, volver a colocar la parte que no se va usar en el sobre de aluminio,
  • cerrarlo bien y devolverlo a la heladera inmediatamente.
  • Dejar que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de
  • comenzar con el protocolo.
  • Observar que los sueros no estén lipémicos ni hemolizados.
  • Titular el conjugado. Sugerimos este esquema:
  2n n n/2
Positivo fuerte ++++ +++ ++
Positivo débil ++ + -
Negativo + -

-

n: dilución sugerida por el fabricante.

Durante el desarrollo de la técnica

  • La punta del tip no debe tocar nunca el tejido.
  • Al lavar evite apuntar el chorro directamente sobre el área reactiva. En el caso
  • de improntas con dos hileras de pocillos, aplicar el buffer de lavado sobre el
  • espacio que hay entre ellas, lavando primero una hacia un borde y luego la otra
  • hacia el otro para evitar contaminaciones.
  • No realice un solo lavado de 10’ sino dos de 5’.
  • Una vez comenzada la técnica no dejar que las improntas se sequen, mantener
  • siempre en cámara húmeda o en el coplin con el buffer de lavado.
  • Respetar los tiempos de incubación.
  • Controlar periódicamente el ph del medio de montaje.